不同的實(shí)驗(yàn)方法需要不同的抗體特性，因?yàn)榭乖圆煌姆绞匠尸F(xiàn)。在變性SDS-PAGE 后，抗原可能是蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)中呈線性的氨基酸序列，或者在細(xì)胞免疫分離、免疫沉淀或基于 ELISA 的方法中整體是天然結(jié)構(gòu)。在免疫染色中，必須檢測(cè)固定細(xì)胞或組織中的交聯(lián)、化學(xué)修飾結(jié)構(gòu)。這意味著一種抗體可能在一種應(yīng)用中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，但在另一種應(yīng)用中卻不適用。這也意味著一種檢測(cè)的特異性并不能保證在不同應(yīng)用中的特異性。必須對(duì)所有應(yīng)用程序獨(dú)立進(jìn)行驗(yàn)證。下面詳述下抗體驗(yàn)證的八種方法：
1. 省略一抗
這是測(cè)試由二級(jí)試劑引起的潛在背景的有用且重要的控制。然而，這個(gè)實(shí)驗(yàn)沒有提供關(guān)于一抗質(zhì)量的信息。
2.抗體信號(hào)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致
WB 中觀察到的分子量、組織分布和染色模式與文獻(xiàn)一致。這種驗(yàn)證方法很容易執(zhí)行，但也有一些限制；例如，WB 中條帶的正確分子量并不一定會(huì)告訴您該條帶是所需的目標(biāo)蛋白質(zhì)。在 WB 中很容易有數(shù)百種蛋白質(zhì)以相同的速度運(yùn)行，這可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)結(jié)果的誤解。文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)也可能不正確或不完整。
3. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞以過表達(dá)靶抗原
在表現(xiàn)出弱內(nèi)源性表達(dá)或無內(nèi)源性表達(dá)的細(xì)胞系中，過表達(dá)靶蛋白可以給出抗體特異性和敏感性的問題。通過這種方法可以很容易地評(píng)估與同一蛋白質(zhì)的不同亞型的反應(yīng)性。然而，人為的高水平靶蛋白通常不能反映內(nèi)源性表達(dá)水平。組織或細(xì)胞裂解物中預(yù)期大小或定位的干凈信號(hào)，已知含有目的蛋白質(zhì)，結(jié)合過表達(dá)系統(tǒng)中的陽性結(jié)果，是特異性的良好指標(biāo)。
4.用免疫原阻斷/預(yù)吸附抗體
特別是對(duì)于多克隆血清，這是確定觀察到的信號(hào)是否與免疫抗原相關(guān)的有用實(shí)驗(yàn)。如果信號(hào)在預(yù)吸附后消失，則該信號(hào)很有可能是特異性的。然而，不能排除與共享類似抗體結(jié)合表位的其他蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)的可能性（可在此處找到建議的預(yù)吸附方案）。
5.KO細(xì)胞或組織
KO(Knock-out)敲除測(cè)試抗體特異性的金標(biāo)準(zhǔn)。與野生型相比，KO中的信號(hào)丟失是特異性的zui可靠證據(jù)。請(qǐng)記住，在蛋白質(zhì)印跡中成功的KO驗(yàn)證并不能保證在其他應(yīng)用（如免疫染色）中的特異性。不幸的是，KO細(xì)胞或組織并不總是可用的。
6.KD-細(xì)胞或組織
KD(Knock-down)目標(biāo)的敲低也可以告訴您很多關(guān)于抗體特異性的信息。與KO相比，通過 RNAi下調(diào)蛋白質(zhì)通常更快、更容易完成。根據(jù)降低的mRNA水平，與對(duì)照系統(tǒng)相比，KD模型中的信號(hào)或染色應(yīng)減少。有時(shí)KD不是很有效，結(jié)果的解釋可能很困難。
7.IP或ELISA應(yīng)用的IP/MS驗(yàn)證
免疫沉淀 (IP)以及隨后通過質(zhì)譜(MS)進(jìn)行的蛋白質(zhì)鑒定是分析IP或ELISA應(yīng)用的抗體特異性的強(qiáng)大工具。然而，這種方法并沒有告訴您很多關(guān)于其他應(yīng)用（如蛋白質(zhì)印跡或免疫染色）中抗體特異性的信息。
8.針對(duì)同一目標(biāo)不同表位的抗體
這種驗(yàn)證方法可以提供有關(guān)抗體特異性的寶貴數(shù)據(jù)，尤其是在免疫染色或蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用中。用針對(duì)同一目標(biāo)但具有不同表位的抗體獲得的匹配染色模式為其特異性提供了很好的證據(jù)。結(jié)合靶蛋白不同部分的不同抗體不太可能具有相同的非特異性結(jié)合配偶體。
總結(jié)：
如果你有 KO 模型，則抗體的驗(yàn)證非常簡單明了。如果這個(gè)黃金標(biāo)準(zhǔn)不可用，則必須收集盡可能多的關(guān)于目標(biāo)和抗體本身的信息和驗(yàn)證數(shù)據(jù)，以產(chǎn)生高概率的特異性。
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